称取一定量WPI，加无C02水配制成3％(w／v，以蛋白质计)底物浓度，90℃灭酶10min，冷却至室温后，调节至最适pH值，加入5％(w／v)酶，充分混匀，置于超级恒温器中，调节温度至55℃开始反应，酶解5h，间隔一定时间，定量移取，通过煮沸2min灭酶终止反应，10000rpm离心20re_in，取上清液测定水解度。
　　
　　1．4TNBS法测定水解度　　
　　

      参考Adler-Nissenn0~123方法略作修改，酶解液0．125ml，加入含有lm1磷酸盐缓冲液(0．2125mol／LNaH2P04加入0．2125mol／LNa2HP04中直至pH值为8．2±0．02)小管中，再加入1ml0．1％(w／v)TNBS，在避光条件下，放入50℃恒温水浴锅中，振荡反应60min后取出，室温冷却20min，再加入2ml0．1mol／LHCI终止反应，稍微振荡一下，在340nm波长处测定吸光度。标准曲线绘制采用L一亮氨酸作标准品，在0---,40mmol／L范围内绘制。DH计算公式如(1)所示：

　　
　　式中：Am为蛋白水解前氨基氮含量，(rnmoL／g蛋白)；AN2为蛋白水解后氨基氮含量(mmoL／g蛋白)；N口b为蛋白底物中肽键氮含量(mmoL／g蛋白)，即蛋白氮。
　　
　　1．5pH—Stat法测定水解度
　　
　　pH—Stat法主要是基于蛋白质水解过程中，总伴随质子释放或吸收n3~1钔，质子化多少，依赖于溶液pH，通过加入用于维持体系pH的碱或酸量，直接计算水解度。DH计算公式如(2)所示：

　　
　　式中：B为NaOH标准溶液体积，(m1)：Nb为NaOH标准溶液浓度，(mol／L)；Q为氨基离解度；M。为底物中蛋白质总含量，(g)；Htot为底物蛋白质肽键总数，(mmol／g)，本文核桃蛋白Htot值是8．0mmol／g。
　　
　　1．6甲醛滴定法测定水解度
　　
　　取水解灭酶后8．0ml酶解液，置于200ml烧杯中，加入60IIll无C02水，开动磁力搅拌器，加少量碱液调节pH为8．20，再加入10Ⅱll中性甲醛溶液，用0．5mol／LNaOH标准溶液调节体系pH值至9．20，记录消耗NaOH标准溶液体积为V(m1)。
　　
　　同时取未酶解相同浓度蛋白质溶液8．0ml，按上述方法作空白试验，记录消耗NaOH标准溶液体积为vo(m1)。DH计算公式如(3)所示：

　　
　　式中：C为NaOH标准溶液浓度，(mol／L)；V为酶解液消耗NaOH标准溶液体积，(m1)；V0为空白液消耗NaOH标准溶液体积，(m1)；0．014为氮毫克当量；N为底物样品总氮含量，(g)。
　　
　　2结果与讨论
　　
　　2．1L-亮氨酸标准曲线
　　
　　按1．4方法选用L_亮氨酸作标准品，TNBS显色后测定吸光度，绘制标准曲线，见图1。由图l可看出，游离氨基质量浓度与吸光度呈线性关系，线性方程为：r--o．1208x+0．0555，R2=o．9917，换算成Jd心关系为C=8．278A-o．459(mmol／L)

　　
　　2．2三种方法测定结果
　　
　　2．2．1Alcalase2．4L酶解WPI测定结果
　　
　　本实验在一定酶解条件下，即3％核桃蛋白溶液(w／v)、加入5％(w／v)Alcalase2．4L、调节pH值为8．0、温度为55℃，间隔不同酶解时间后，移取酶解液分别进行水解度测定。测定水解度时甲醛滴定法和TNBS法都是基于对游离氨基酸进行定量，预期两种方法测定水解度比较接近，但数据显示并不接近。由图2可看出，在采用Alcalase2．4L酶解核桃分离蛋白时，pH—Stat法和TNBS法测定值接近，方差分析结果表明，TNBS法仅比pH—Stat法平均低0．4％。而甲醛滴定法比两者稍低，这是因脯氨酸与甲醛作用后，生成不稳定化合物，导致滴定结果偏低。
　　
　　因此采用甲醛滴定法测定富含脯氨酸原料，其结果偏低；采用甲醛滴定法测定微弱水解物水解度时，误差较大。核桃蛋白质含有一定量脯氨酸(4．29％)n卯，脯氨酸与甲醛反应生成不稳定化合物，导致测定结果偏低；而TNBS法并未有此现象，这就解释TNBS法测定结果与pH—Stat法基本一致，而甲醛滴定法偏低结果。

　　
　　2．2．2Protamex酶解WPI测定结果
　　
　　核桃分离蛋白酶解因目标物是短肽，所以应尽量避免使用外切蛋白酶。根据文献相关报道，本实验除采用水解度较高Alcalase2．4L(内切蛋白酶)外，还根据目标物生理活性，选用Protamex(内切和外切肽酶复合体)进行酶解。加入5％Protamex、调节pH值为7．0、温度为50℃，经不同酶解时间后，取酶解液分别进行水解度测定。

　　
　　由图3可知，与Alcalase2．4L酶解不同的是，用Protamex酶解时，甲醛滴定法与pH-Stat法接近，均低于TNBS法；方差分析结果表明，TNBS法测定结果与另两法差异显著(P<0．05)。甲醛滴定法偏低原因在2．2．1已予解释；而pH-Stat法测定值偏低是由于其水解度计算与l／a有关，而Ct与温度、pH值及氨基解离度(pK)有关，计算公式如(4)式：

　　
　　在Protamex酶解条件下，若温度和pH值都不变，a仅取决于pK值，由于游离氨基酸、二肽和三肽氨基基团pK值比多肽稍高¨们，采用Protamex水解时，由于含部分外切酶，所以酶解产物含有较多游离氨基酸和二肽、三肽，故在用pH-Stat法测定水解度时I／a偏低就导致计算水解度降低。在用Alcalase2．4L进行酶解时，由于是内切肽酶，游离氨基酸和二肽、三肽很可能会相对降低，这意味在水解过程中I／0【值变化可忽略不计，pH-Stat法测得值应较精确，
　　
　　3结论
　　
　　pH—Stat法被证实是一种简单、快速测定WPI水解液水解度方法，可重复性高，通常被用于水解度连续测定。然而该法在研究中需用其它方法加以校正，且所测得水解度值精确度依赖于所使用酶种类；当使用富含外切蛋白酶时，pH—Stat法所测水解度值低于预期值。甲醛滴定法也是一种较为常用测定WPI水解度方法；但因WPI富含脯氨酸，与甲醛生成不稳定产物，使测定值偏低，所以测定核桃分离蛋白时，甲醛滴定法精确度较低。TNBS法被证实也是一种较好测定WPI水解度方法，非常灵敏，且不受酶特异性影响；但由于需要较长反应时间和冷却步骤，所以，不能实时反应水解过程水解度。
　　
　　但值得一提的是，酶解WPI获取多肽主要目标物是短肽，使用的酶大多为内切蛋白酶：所以，采用pH—Stat法测定WPI水解液水解度时所得值应较为准确