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含多不饱和脂肪酸油脂的功能性已经为消费者所了解和接受,例如含有二十二碳六烯酸(22∶6n-3;DHA)的金枪鱼油和含有γ-亚麻酸(18∶3n-6;GLA)的琉璃苣油已经应用于功能性食品和婴儿食品配料中。最近,含有花生四烯酸(AA)单细胞油也已经用于婴儿食品配料中。自1991年来,日本已经将二十碳五烯酸乙酯(EtEPA)用于治疗动脉硬化和高血脂,应用效果显著。最近研究表明,DHA、GLA和AA也有望作为医药应用,这对此类脂肪酸产品开发与品质提出了更高的要求,它们的纯化方法研究已经成为亟需解决的问题。
目前,工业上采用蒸馏和脲包法纯化二十碳五烯酸乙酯。据有关报道,采用蒸馏、脲包、高压液相色谱或银离子交换色谱技术可以对DHA和GLA进行纯化,但此工艺由于其生产成本过高而无法实现工业化生产。因此,更多的研究者转向酶反应技术的研究。
一般来说,酶对多不饱和脂肪酸的反应活性较弱,利用酶的这个性质,Hoshino等富集了鱼油水解后甘油酯相中的多不饱和脂肪酸,包括EPA和DHA。SyedRahmatullah等也报道了通过酶水解琉璃苣油可以获得富含GLA的油,在此反应中,C1rugosa酶反应效果较好,同样采用这种酶对含有花生四烯酸的单细胞油进行水解也可获得富含花生四烯酸的油。目前,日本的富含DHA和GAL油脂的工业化生产就是采用酶选择性水解实现的,这些产品在功能性食品中得到了广泛应用。日本学者也曾试图采用酶选择性水解非多不饱和脂肪酸酯键以达到提高油中多不饱和脂肪酸的含量,但很难使其含量超过70%(W%),这主要是因为酶对多不饱和脂肪酸酯键也有一定的水解能力。
后来随着人们研究的深入,发现酯化过程中酶对脂肪酸的专一性要比在水解过程更明显,利用这个性质,Hills等首先利用酶催化酯化反应来纯化多不饱和脂肪酸,他们首先由月见草油制得游离脂肪酸(FFA),后在己烷溶剂相采用固定化酶,使脂肪酸与丁醇发生酯化反应,他们用此法成功地使GLA在脂肪酸中的含量提高到85%(W%),回收率为64%,如果采用酶技术在非溶剂相中可以实现上述目标,则其工业化前景十分可观,这也引起了学者对工业化纯化多不饱和脂肪酸非溶剂相方法研究的极大兴趣。
1选择性酯化纯化多不饱和脂肪酸(PUFA)
工业化选择性酯化纯化多不饱和脂肪酸工艺主要是要求体系具有以下两个条件:具有高度脂肪酸专一性和高酯化度的酶反应体系;从含有醇、游离脂肪酸和脂肪酸酯混合物中分离出游离脂肪酸的低破坏性方法。
在上述方法中,酶将游离脂肪酸和醇视为反应底物,因此,相对传统方法来说,即使在水相中以脂肪酸作为底物也可以提高酯化的程度。对于进一步分离过程,研究者多采用分子蒸馏设备作为分离手段,这主要是从运行成本和分离效果考虑,同时这也是有关学者在科学研究中技术平台概念的具体应用。在醇的选择上,他们一般选用月桂醇(LauOH)作为底物,主要是因为在长碳链醇中其价格最低,另外,它的分子量与脂肪酸和脂肪酸酯也有较大差别。众多研究结果也证明,游离脂肪酸与月桂醇在20%水相中可达到理想的酯化程度,图1中给出了采用选择性酯化纯化多不饱和脂肪酸的工艺流程。
此工艺的第一步是含多不饱和脂肪酸油脂的水解,水解方法采用乙醇相碱性条件下水解,工业化过程中此过程需要较大的反应器,而且反应过程中也有多不饱和脂肪酸发生异构化的可能,反应产生废水含有乙醇,并具有较高的化学需氧量(COD)值,为了进一步分离未反应的游离脂肪酸,需将反应混合物的pH调节至酸性条件,再进行进一步处理。与此相比,如果工业化生产中采用酶法水解,采用分子蒸馏就可分离游离脂肪酸,过程简单。
此外,采用专一性的酶水解多不饱和脂肪酸油脂也可富集多不饱和脂肪酸,但迄今为止具有多不饱和脂肪酸专一性的酶尚未发现,因此,日本学者采用一种对多不饱和脂肪酸具有一定反应活性的酶进行研究。首先,非选择性水解含多不饱和脂肪酸油脂,采用分子蒸馏分离游离脂肪酸;第二步采用对多不饱和脂肪酸低选择性酶催化游离脂肪酸和月桂醇酯化,这样达到富集多不饱和脂肪酸的目的,后采用分子蒸馏设备分离游离脂肪酸。以下将对酶法纯化多不饱和脂肪酸的具体应用情况进行介绍。
1.1金枪鱼油中DHA的纯化
该研究是以金枪鱼油作为原料,采用非溶剂体系的小试研究过程,其游离脂肪酸分离采用正己烷提取,反应过程中采用两种酶,这两种酶对于酯化DHA的专一性比对EPA专一性强。该方法的第一步是水解金枪鱼油[DHA含量为22%(W%)];第二步,在酶催化下对游离脂肪酸和月桂醇进行选择性酯化反应,在对各反应条件进行优化后,最终DHA在游离脂肪酸中的含量可提高到75%,然后通过分离游离脂肪酸进行二次反应可使DHA含量提高到91%(W%),DHA回收率为60%(相对金枪鱼油中所含DHA量)。
1.2单细胞油脂中花生四烯酸(AA)的纯化
该研究是以含AA25%(W%)的单细胞油脂为原料进行研究,非选择性水解过程采用的酶为Pseu2domonasSP,反应生成的游离脂肪酸采用正己烷进行分离,由于在酯化过程中,AA也有一定程度的酯化,因此该研究采用C1rugosa酶进行酯化,酯化过程AA几乎没有发生酯化,一次酯化可使游离脂肪酸中AA的含量提高到51%(W%),由于C.rugosa酶对GLA、二十二碳酸及二十四碳酸的反应活性较弱,因此游离脂肪酸中这些组分的含量也较丰富。
正己烷提取的游离脂肪酸中含有长碳链饱和脂肪酸,所以它在反应温度下(30℃)呈固态,这部分饱和脂肪酸可采用脲包法进行分离,然后再进行选择性酯化反应以进一步提高AA的含量。经过纯化,AA的含量可提高到75%(W%),回收率71%(相对原料中AA量),其中n-6系列多不饱和脂肪酸由30%(W%)提高到89%(W%)。
1.3琉璃苣油中γ-亚麻酸(GLA)分离提纯的工业化生产
大量的研究证明,通过与LauOH发生选择性酯交换可以有效地从金枪鱼油和含AA的单细胞油脂中分离和纯化DHA和n-6多不饱和脂肪酸,同样对小规模由琉璃苣油中纯化GLA,选择性酯交换也是一种非常有效的方法。在工业化生产方面,日本学者对大规模工业化纯化GLA工艺进行了研究。在纯化过程中,他们使用原料油中含有45%(W%)GLA,这种油脂是通过C1rugosa酶选择性水解琉璃苣油的方法制备的。Pseudomonas和Al2caligens酶对GLA酯具有很强的反应活性。在第一步水解中,使用PseudomonasSP酶进行水解,水解率为92%,后通过分子蒸馏收集油层的游离脂肪酸,在Rdelemar酶催化下游离脂肪酸进行选择性酯化,GLA的含量提高到8915%(W%),反应体系中含有LauOH(分子量为186),游离脂肪酸(GLA,278)和脂肪酸月桂酯(分子量大于460),从它们的分子量情况可以看出,采用分子蒸馏技术可对其进行分离。
脂肪酸提取部分中含有1815%(W%)脂肪酸月桂酯,但这部分酯对GLA富集影响不大,通过进一步纯化,GLA含量可增加至97.3%(W%),经过多步纯化过程,GLA相对原料(45%GLA)中GLA回收率为44%。由此得出结论,采用酶反应,蒸馏和脲包法可以有效纯化GLA,这种工艺同样可用于其他多不饱和脂肪酸的纯化。
2选择性醇解纯化多不饱和脂肪酸乙酯(EtPUFA)
从多数研究者报道情况看,选择性酯化纯化多不饱和脂肪酸乙酯需经过三步:含多不饱和脂肪酸油脂的非选择性水解;游离脂肪酸与月桂醇选择性酯化;多不饱和脂肪酸的乙酯化。
如果脂肪酸乙酯(EtFA)与月桂醇之间能进行选择性醇解,那么多不饱和脂肪酸酯的富集就可分两步进行:多不饱和脂肪酸油脂的非选择性的乙酯化反应;选择性的醇解。在此思路指导下研究者设计了如下工艺。
在此工艺中,第一步是将含多不饱和脂肪酸油脂转化为相应的乙酯。此过程可采用碱催化的化学乙醇反应方法,在沙丁鱼油生产EPA乙酯的工业化生产中也是采用化学方法,但与化学方法相比,采用温和条件的酶法则更为理想,因为在碱性条件下进行加热可能会导致多不饱和脂肪酸的异构化,在反应后通过分子蒸馏将不同碳链长度的脂肪酸乙酯加以分离。第二步是富含多不饱和脂肪酸的脂肪酸乙酯混合物的选择性醇解。如果是以月桂醇为反应底物则最终的反应混合物中含有月桂醇(分子量为186),脂肪酸乙酯(多不饱和脂肪酸乙酯的分子量为328)和脂肪酸月桂酯(分子量为422以上),这些组分采用分子蒸馏就可进行有效分离,通过此工艺可以有效对多不饱和脂肪酸乙酯进行纯化。
2.1金枪鱼油制备高纯度多不饱和脂肪酸乙酯(EtPUFA)
据报道,在固定化酶催化下,甘三酯可与短碳链醇发生反应,但此反应体系要求有机溶剂体系(正己烷),否则固定化酶不能多次使用,基于工业化生产考虑,日本学者提出了新的体系:非有机溶剂相以防爆炸隐患;固定化酶的反应活性可维持相当长时间。
目前美国、日本学者对酶法将废弃食用油转化为乙酯(生物燃料)进行过大量的研究,在此过程中他们发现,当固定化酶接触到甲醇时就会失去活性,甲醇在该反应混合物中是不溶解的,但他们通过逐渐加入甲醇可有效地将废油转化为生物燃料,他们将此发现用于乙醇与金枪鱼油反应体系。第一步反应是加入金枪鱼油中总脂肪酸摩尔数三分之一的乙醇,使用的酶为C.antarctica,在反应体系中乙醇全部反应后分别加入另外三分之二摩尔数的乙醇(每个反应周期为48h),反应结束后96%甘三酯转化为脂肪酸乙酯,而酶在使用100d后其活性几乎没有发生变化。
将脂肪酸乙酯进行分子蒸馏分离,此过程可使DHA乙酯由原来的23.7%(W%)提高到57.2%(W%),DHA乙酯的损失很少,在非水相体系中,在酶催化下脂肪酸乙酯和月桂醇之间的醇解反应可以顺利进行。日本学者报道了用固定化酶与月桂醇选择性醇解的有关情况,增加月桂醇的量对于长时间的醇解反应具有促进效果,对于脂肪酸的选择性也有所改善,但过量的月桂醇会降低反应产物中乙酯的量,同时也需要更大的反应器,由此他们将月桂醇定量为脂肪酸乙酯摩尔数的7倍,在此条件下,醇解可达50%左右,DHA乙酯的含量也提高到90%(W%),如果醇解反应是在固定化床生物反应器上进行的,酶的使用超过200d。
月桂醇、脂肪酸乙酯和脂肪酸月桂酯可通过分子蒸馏进行分离,脂肪酸乙酯中脂肪酸月桂酯的含量很低,采用脲包法可除去,DHA乙酯的最终得率为52%。
2.2共轭亚油酸(CLA)异构体的分离
CLA是顺式或反式结构中有共轭双键的C18脂肪酸。工业上,CLA是红花籽油或葵花籽油在丙二醇或乙二醇中碱催化下共轭化产生,制备的产品中含有几乎等量的顺9,反11(c9,t11)和反10,顺12(t10,c12)异构体,此CLA混合物具有多种生理功能。实验证明,CLA具有预防癌症,减少人体脂肪,预防粥样动脉硬化和增强免疫功能。天然CLA存在于肉中和反刍动物的奶中,主要的异构体为c9,t11-CLA,其含量达CLA的75%,尽管人们在多数生理功能研究中使用CLA混合物,根据最近报道,t10,c12-CLA参加降脂过程,c9,t11-CLA具有抗癌作用,激发了学者对于CLA分离研究的兴趣。
最近,有关学者报道采用酶法可有效分离CLA异构体,Haas等[21]研究表明,G1candidum酶对c9,t11-CLA的选择性远大于对t10,c12-CLA的选择性,他们先在有机溶剂相中将CLA异构体与甲醇进行酯化,后成功地从反应的初始产物中分离了c9,t11-CLA甲酯,与此同时,Mcmeil等也报道了采用酶可反应分离c9,t11-和t10,c12-异构体。他们将CLA异构体与月桂醇进行酯化反应,并对反应产物进行分离,一部分为游离脂肪酸(富含t10,c12-CLA),另一部分为脂肪酸月桂酯(富含c9,t11-CLA),同系结构的酶具有相似的性质,G.candidum与C.rugosa属于同一系酶,因此,Mcneill等选用C.rugosa酶作为催化剂,通过两步反应成功地纯化了c9,t11-CLA(95.6%)和t10,c12-CLA(94.9%)。
3结束语
酶技术成为现代快速发展技术之一,它在油脂中也有广泛应用和研究,但将该技术用于油脂相关功能性物质的纯化尚不多见。通过国外相关研究表明,酶技术在纯化多不饱和脂肪酸,分离CLA异构体,纯化维生素E和植物甾醇方面具有重要的实用价值。另外,在众多酶技术研究中,在最后产品分离时大多采用分子蒸馏,而不采用溶剂分离技术,这也是基于技术平台概念的具体应用,这部分研究对于酶技术的推广和应用也具有重要意义。
