公告信息：
大量研究表明，茶皂苷具有良好的乳化、分散、润湿、发泡以及去污等表面活性，同时还具有抗渗、消炎、抗氧化、杀菌、抗高血压、抑制酒精吸收等生物活性。中药材的有效成分往往包裹在细胞壁内，而植物细胞壁的主要成分为纤维素，利用纤维素酶酶解可以破坏纤维素上的一D一葡萄糖苷键，使细胞壁遭到破坏，有利于有效成分的溶出J。目前，纤维素酶应用在茶皂苷提取中的研究所见不多。鉴于此，本文利用纤维素酶辅助提取茶籽粕中茶皂苷，以茶皂苷得率为指标，通过正交试验优化提取工艺条件。
1材料与方法
1．1试验材料
1．1．1原料、试剂
茶籽粕，由玉溪师范学院提供；茶皂苷标准品，购于西安依科生物技术有限公司；纤维素酶(酶活10000U／g)，购于诺维信(中国)生物技术有限公司。石油醚、冰乙酸、乙酸钠、无水乙醇、香草醛、浓硫酸等，均为分析纯。
1．1．2仪器、设备
PB一10标准型pH计，7230G型可见分光光度计，HH一2型数显恒温水浴锅，DZF一6050型真空干燥箱，SNE一3000M型移动式形貌分析系统(韩国赛可有限公司)。
1．2试验方法
1．2．1茶皂苷的提取
准确称取5g经石油醚脱脂的茶籽粕，加入40mL调好pH的乙酸一乙酸钠缓冲溶液，加人一定量的纤维素酶，充分搅拌后置于恒温水浴酶解一段时间。酶解结束后，升温至85℃灭酶5min。离心，取上层提取液测定茶皂苷含量。
1．2．2茶皂苷的含量测定
标准曲线的绘制_5]：精密称取干燥至恒重的茶皂苷标准品30．1mg，用80％乙醇定容至50mL。从中精密吸取0．1、0．2、0．3、0．4、0．5mL样品溶液置于5支试管中，分别用80％乙醇补至0．5mL。各加入8％香草醛的乙醇溶液0．5mL、77％硫酸5mL，于60oI=水浴加热20min，立即置于冰水浴中冷却10min，取出。待温度降至室温，以试剂空白为参比，于545nm处测定吸光度。以吸光度A为纵坐标，茶皂苷质量浓度C(mg／mL)为横坐标绘制标准曲线，其回归方程为：A=9．5585C+0．0019(R=0．9998)。
提取液中茶皂苷的测定及得率计算：取1mL提取液置于10mL具塞试管中，用80％乙醇定容，摇匀。从中移取0．1mL样品溶液并用80％乙醇补至0．5mL，按照绘制标准曲线的方法加人显色剂进行显色，测定吸光度，代入回归方程计算可得到茶皂苷的质量(mg)，再以其计算得率。
茶皂苷的质量=600(A一0．0019)V／9．5585式中：600为稀释倍数；A为溶液的吸光度；V为茶皂苷提取液体积，mL。得率=提取所得茶皂苷的质量／脱脂茶籽粕的质量×100％
2结果与讨论
2．1酶解条件的单因素试验
2．1．1pH对茶皂苷得率的影响在酶解温度5O℃、酶解时间120min、纤维素酶加入量1．25mg／mL(纤维素酶加入量均以40mL提取液计，下同)的条件下提取茶皂苷，不同pH对茶皂苷得率的影响结果见图1。
由图1可知，当乙酸一乙酸钠缓冲溶液pH为5．0时茶皂苷得率达到最大值，pH偏大或偏小都会破坏纤维素酶的空间构象，降低酶的活性。因此，pH取5．0较为适宜。
2．1．2酶解温度对茶皂苷得率的影响在pH5．0、酶解时间120min、纤维素酶加入量1．25mg／mL的条件下提取茶皂苷，不同酶解温度对茶皂苷得率的影响结果见图2。
由图2可知，茶皂苷得率随酶解温度先增大后减小，且在45℃时茶皂苷得率达到最大值。故酶解温度选择45℃。
2．1．3酶解时间对茶皂苷得率的影响在pH5．0、酶解温度45℃、纤维素酶加入量1．25mg／mL的条件下提取茶皂苷，不同酶解时间对茶皂苷得率的影响结果见图3。
由图3可知，茶皂苷得率在酶解时间为120min时达到最大值，继续延长酶解时间，茶皂苷得率变化幅度不大，且存在逐渐降低的趋势。可能是由于酶解时间过长，纤维素酶破坏了部分茶皂苷的结构。因此，酶解时间选择120min。
2．1．4纤维素酶加入量对茶皂苷得率的影响在pH5．0、酶解温度45℃、酶解时间120min的条件下提取茶皂苷，不同纤维素酶加入量对茶皂苷得率的影响结果见图4。
由图4可知，纤维素酶加入量从0．375～1．125me／mL时，茶皂苷得率显著升高，当纤维素酶加入量超过1．125me／mL时，茶皂苷得率反而呈现略微下降的趋势，可能是纤维素酶加入量过高造成部分茶皂苷的分解。因此，纤维素酶加入量选择1．125me／mL。
2．2酶解条件的正交设计优化
2．2．1正交试验
根据单因素试验的结果，选择pH、酶解温度、酶解时间、纤维素酶加入量4个因素，设计L。正交试验。正交试验的因素水平见表1，试验结果见表2。
由表2极差分析的结果可知，各因素对茶皂苷得率的影响程度为：A>D>C>B，即pH对茶皂苷得率的影响最大，其次是纤维素酶加入量、酶解时间、酶解温度。酶法辅助提取茶皂苷的最佳工艺为A3B3C，D，即pH5．1、酶解温度47℃、酶解时间130rain、纤维素酶加入量1．125me／mL。
2．2．2验证试验
在最佳酶法提取工艺条件下，进行3组平行验证试验。经茶皂苷含量检测，其平均得率为20．23％，优于各组正交试验。
2．3酶解前后茶籽粕的扫描电镜分析
对纤维素酶酶解前后的脱脂茶籽粕进行了扫描电镜分析，结果见图5、图6。
从图5、图6可以看出，酶解前的脱脂茶籽粕表面较为平整光滑、茶籽粕颗粒之间无明显粘连现象；而酶解1h后的脱脂茶籽粕表面粗糙、茶籽粕颗粒之问互相粘连、茶籽粕颗粒的结构遭到破坏。这从另一方面验证了纤维素酶对茶籽细胞壁的破坏作用。
3结论
以茶籽粕为原料，将纤维素酶解辅助提取技术运用到茶皂苷的提取中。通过单因素试验和正交试验得出的最佳提取工艺为：pH5．1，酶解温度47℃，酶解时问130min，纤维素酶加入量1．125me／mL。在此条件下进行验证试验，茶皂苷得率为20．23％。对酶解前后的脱脂茶籽粕进行的扫描电镜分析表明：酶解后茶籽粕颗粒表面变得粗糙、颗粒之间相互粘连，说明纤维素酶破坏了茶籽细胞壁，从而促进茶皂苷的溶出。
