目前，通常采用温浸、超声辅助等方法提取油菜籽中的原花青素，但其操作步骤较为复杂，且耗时长，同时所需溶剂量相对较大。加速溶剂萃取(Acceleratedsolventextraction，ASE)是在较高温度和压力条件下，采用有机溶剂从固体或半固体基质中提取分析物的一种全新样品前处理技术，具有萃取时间短、溶剂用量少、提取率高、操作模式简单、自动化程度较高及重复性好等优点。在食品、农药残留等方面得到广大应用，该技术已经被美国环保局批准为EPA3545号标准方法。
　　
　　响应面最早是由数学家Box和Wilson于1951年提出来，常用的正交试验法只能得出最佳实验组合，不能充分的反映因素间对于实验结果的相互影响，而响应面法是统计设计和实验技术相结合的一种软件，其应用领域十分广泛，但现阶段在天然产物分析中应用较少。
　　
　　本实验以油菜籽饼粕为原料，采用加速溶剂萃取法提取原花青素，响应面分析法优化最佳提取条件，并与超声提取法进行了对比。
　　
　　1材料与仪器
　　
　　1．1材料油菜籽购于平安种业公司；Folin—Ciocaheu试剂、没食子酸、2，2一diphenyl一1一picrylhydrazyl[DPPH·]购自美国Sigma公司(S．tLouis，Mo)；无水乙醇为分析纯试剂(购于北京精细化学品有限责任公司)；水为超纯水18．21~Pa。
　　
　　1．2仪器
　　
　　ASE一150加速溶剂萃取仪(美国Dionex公司)；Beckman—DU800型紫外可见分光光度计(美国Beckman公司)；N一1001旋转蒸发仪(上海爱郎仪器有限公司)；BS一124S电子天平(德国)；Elma—S180H超声清洗器(德国)；加样枪(德国)。
　　
　　2方法
　　
　　2．1ASE提取精密称取20目油菜籽饼粕2．0064g置小烧杯中，然后与6．0012g硅藻土进行完全混合，按照加速溶剂萃取仪样品制备程序，以乙醇为溶剂，按响应面实验设计表1选择因素和水平进行提取，萃取后的溶液旋转蒸发至干(<50oC)，用60％的乙醇4ml溶解，过0．45m的微孔滤膜，得样品溶液，在一4℃冰箱内储存。
　　
　　2．2传统超声提取称取20目油菜籽饼粕2．0064g，置于锥形瓶中，按料液比1：20(g／m1)加入60％的乙醇溶液，在60℃下超声20min，超声3次。过滤后的溶液旋转蒸发至于(<50℃)，用60％的乙醇4ml溶解，过0．45m的微孔滤膜，得样品。参照“2．3．2”项下测定其含量。
　　
　　2．3油菜籽原花青素含量的测定
　　
　　2．3．1标准曲线的绘制配制质量分数浓度100ml的没食子酸标准溶液，分别移取0，0．05，0．10，0．20，0．30ml于10ml容量瓶中，再分别加入0．5mlFolin—Ciocalteau试剂(2mol／L)。摇匀后加人3ml10％NaCO溶液，再用蒸馏水定容，于75℃水浴中反应10min，测定波长为765nm的吸光度值。以吸光度(A)对没食子酸浓度(C)进行线性回归分析，考察其在0，5～3．5ml范围内的线性关系。见图1。
　　
　　2．3．2含量的测定按响应面设计方案，参照“2．1”项，制备17份样品。准确移取样品溶液10l，用60％乙醇稀释10倍后取501，按“2．3．1”项方法处理样品溶液，同样测定波长为765nm的吸光度值，代入回归方程计算得到原花青素含量。
　　
　　2．4实验设计选择乙醇浓度、萃取温度和循环次数三个因素为自变量，以原花青素含量为晌应值(Y)，根据Box—Behnken中心组合试验设计原理，综合张小军、吴娟提取原花青素的最佳条件的基础上，采用3因素3水平的响应面分析方法，试验设计因素及水平见表1。
　　
　　3结果与讨论
　　
　　3．1响应面分析采用Box—Behnken按表1响应面分析因素及水平表设计实验，共17组。每个自变量的低中高水平分别以一1、0、1进行编码，以原花青素的提取量为响应值(Y)进行实验，参照“2．1”项进行提取
 

　　3．2多元二次响应面回归模型的建立与分析采用Design—Ex—pert软件对表2的提取量和影响因素进行多元回归分析和最小二乘法拟合，得提取量对编码自变量的二次多项回归模拟方程为Y=5．16—0．40Xl+0．038+0．92X3+0．45X1一0．67X1+0．21X一0．63X】一0．49+0．51X3。该方程表达了油菜籽饼粕中原花青素的提取量与加速溶剂萃取各提取因素之间的变化规律。
　　
　　其中，是效应值，即原花青素的提取量X₁、X₂、X₃是自变量，即乙醇浓度、萃取温度和循环次数3个考察因素。。
　
　　结果表明，该模型的F值为4．46，概率P=0．0308<0．05，表明模型显著。同时，方程的失拟项F值为3．78，概率P>0．05，失拟项不显著。模型的值为0．8514，说明方程的因变量与全体自变量间线性关系较显著，响应值的变化有85．14％来源于所选自变量，即乙醇浓度、萃取温度、循环次数，说明回归方程在整个回归区域的拟合情况良好，可用该回归模型代替实验真实点对实验结果进行分析。
　　
　　原花青素提取量对乙醇浓度、萃取温度、和循环次数的响应面图(见图2～4)。图2～4反映的是一个因素不变的前提下(取值都为0．000)，另外两个因素对于原花青素提取量的相互情况。
　　由图2可知，原花青素提取量随着温度的升高而增加，但增加到一定温度时，继续升高温度提取率有所下降，见图2b，温度为5O℃时，提取量约为4．000mg／g，60℃时，提取量最高，约为5．000mg／g，继续升高温度，提取量明显下降。说明在一定范围内温度的升高有利于原花青素的提取，可当温度继续升高时，原花青素的结构可能由于遭到破坏，导致提取量降低。从图2中分析得到，乙醇在较低的浓度下提取效果较好，说明原花青素易溶于极性较大的溶剂中，但如果乙醇浓度过低，所提取的水溶性杂质增多。
　　
　　由图3可知，循环次数对提取量的影响较为显著，循环次数增大时，原花青素的提取量升高显著。说明随着次数的不断增加，油菜籽饼粕中原花青素提取的越完全。循环一次原花青素的提取量为4．434mg／g，循环两次原花青素的提取量不到5．000m#g，循环3次之后，提取量达到了7．000mg／g左右。循环次数越多，所用的溶剂量就越大，考虑到溶剂的用量，选取循环3次。
　　
　　由图2—4和表3可知，循环次数是影响油菜籽饼粕中原花青素提取量的显著因素。并且由图4可知，循环次数为3次，萃取温度为60℃时，原花青素的提取量最多，达到6．700mg／g左右。

　　通过Design—Expert进行最佳提取条件分析，以原花青素的提取量为考察指标，确定了ASE的最佳提取条件是：X₁=60.83%，X₂=58.32℃，X₃=3，在此条件下，原花青素提取量的理论值为7.060mg/g。考虑到实际操作，确定最佳提取条件为：乙醇浓度60%，萃取温度60%，循环次数3次。同时，在此条件下，进行了验证试验，原花青素的平均提取量为7．217mg／g，油菜籽中原花青素的提取量比张小军的超声法较低，可能由于原料产地、收获季节等有关。
　　
　　3．3与超声提取法的比较ASE与超声提取法主要从溶剂用量、时间、原花青素的提取量3个方面进行了比较。结果见表4。从表4可知，采用ASE提取方法，原花青素的提取量为7．217mg／g，溶剂用量为65ml，时间为40min，无论从溶剂用量、提取时间还是原花青素的提取量来说，都优于超声提取法，并且操作自动化。由此可见，ASE提取方法是一种提取原花青素的新方法。
　　
　　4结论
　　
　　本文采用加速溶剂萃取方法对油菜籽饼粕中原花青素进行提取，经响应面优化了最佳提取条件：乙醇浓度6o％，萃取温度60℃，循环次数为3次，提取量最高可达7．370mg／g，而采用超声法原花青素的提取量不到7．000m#g。响应面法优化提取工艺克服了正交法不能研究因子与响应值之间、因子与因子之间相互关系缺陷。加速溶剂萃取法相比超声提取法具有萃取时间短、溶剂用量少、提取效率高等优势，因此，加速溶剂萃取方法为提取、研究油菜籽饼粕中的原花青素提供了一种简单、快速的分析方法。
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